BBEMG: Effets des champs sur les kératinocytes

Cette étude a comme objectif d’analyser les effets biologiques des champs électriques et magnétiques de fréquences extrêmement basses.

Des kératinocytes, cellules de la couche extérieure de la peau (l’épiderme), sont placés sur un morceau de derme décellularisé (le derme est la couche interne de la peau humaine). Deux électrodes en platine sont utilisées pour appliquer le signal électrique. Nous comparons l’activation des gènes au niveau des cellules exposées et exposées de manière simulée.

Ce modèle simplifié et bien caractérisé permet d’étudier les effets biologiques d’une stimulation électromagnétique.

Vous trouverez ici une présentation de l’étude ainsi que les principaux résultats.

Le derme décellularisé est placé dans une boîte de Pétri contenant un milieu nutritif (en rouge). Les deux côtés du derme sont en contact avec les électrodes.

Des échantillons de kératinocyte (explants) sont pris sur le même donneur et placés sur le derme. Ce modèle reproduit la structure réelle de la peau.
Peau = des couches de cellules dermiques et des couches de cellules épidermiques

Des paires d’échantillons du même donneur sont préparées pour l’étude. Les premiers sont exposés quotidiennement à un champ électrique alors que les autres sont utilisés comme contrôle.

Contrôle

Exposé

Comparaison de la croissance de l’épiderme entre les échantillons contrôles
et les échantillons exposés au champ électrique
(comparaison après 14 jours en culture)

Observation:

Ce qui se passe naturellement, c’est un processus de cicatrisation (voir la zone blanche): les cellules se divisent et l’épiderme croît en bordure des échantillons d’épiderme.

Toutefois:

• sous exposition simulée: plus grande surface de cellules périphériques, ce qui signifie que les cellules se divisent plus activement.
• sous exposition réelle: plus grande épaisseur des cellules périphériques (plus de couches…)

Ce qui est observé sous exposition, c’est donc une augmentation de la différenciation cellulaire (*), au dépend de la prolifération.

Que se passe-t-il au niveau des cellules périphériques (zone blanche)?
Voici une représentation d’une coupe au niveau de la zone blanche (vue au microscope).

Les illustrations montrent des cellules en division et d’autres cellules. Etant donné l’objectif de cette étude, nous approfondissons ici ces dernières. Que se passe-t-il au niveau des cellules qui ne sont pas en division.

Imaginons un microscope très puissant qui nous permettrait de visualiser finement ce qui se passe à l’intérieur de ces cellules. Que verrions-nous?

ADN

ADN et ARN

Le noyau contient l’ADN, une molécule qui stocke notre information génétique. L’ADN est organisé en séquences appelées gènes: notre ADN contient des milliers de gènes. Il est spécifique à chacun des individus.

L’ADN est une sorte de livre de recette: il dit comment une cellule particulière doit travailler. Cependant, pour être utile, l’information des recettes doit passer dans le cytoplasme, la partie active de la cellule (en violet dans les illustrations ci-dessous). Comme l’ADN ne peut sortir du noyau (la librairie), un autre acteur entre en jeu: l’ARN.

L’ARN, ici représenté par le train vert, est la transcription d’un gène particulier. Dans cet exemple, le gène est constitué d’une succession de 6 bases spécifiques (éléments de l’ARN, représenté ici par les wagons). L’ARN voyage vers le cytoplasme (la cuisine de la cellule) pour être traduit en protéines.

Que se passe-t-il dans les deux échantillons de cellules dans cette étude ? Les ARN, transcrits dans le noyau, vont dans le cytoplasme. Comme illustré ci-dessous, les quantités d’ARN et leur origine (gènes transcrits) sont différents en situation d’exposition réelle et simulée.

Contrôle

Exposé

Malheureusement, le microscope capable de faire la différence entre les ARN n’existe pas! Comment les scientifiques peuvent-ils les identifier, et par la même occasion, identifier les gènes activés ? C’est l’objectif du screening par microarray. Cette technique permet d’analyser l’activation des gènes en quantifiant les ARN. A partir de cette analyse, il est possible de comprendre les mécanismes qui se passent au niveau cellulaire.

Dans cette étude, l’objectif est d’identifier les mécanismes cellulaires déclenchés par les champs électromagnétiques en comparant l’ARN dans les cellules exposées et non exposées.

En premier lieu, il est nécessaire de séparer les ARN des autres constituants de la cellule comme les membranes, les organites … Cette étape est appelée purification de l’ARN.

Après destruction des membranes des cellules, l’ARN est filtré et séparé des autres parties de la cellule.

Avant l’étape suivant, une molécule de marquage (par fluorescence) est fixée sur l’ARN. Comme nous le verrons ci-dessous, cette molécule permettra de visualiser la présence et la quantité d’ARN sur la puce (« gene chip »).

A ce moment de l’étude, les chercheurs ont deux échantillons d’ARN, l’un provenant des cellules exposées, l’autre des cellules contrôles. Tous deux seront analysés séparément de manière à déterminer leur composition (*).

Les deux échantillons d’ADN sont mis en contact avec deux puces ou « gene chip » différentes.

Une puce est un outil très ingénieux pour les biologistes: elle est composée de multiples copies d’un morceau spécifique de gènes bien identifiés (par exemple 38 500 pour l’espèce humaine). Ces copies sont organisées sur la puce: les mêmes copies sont groupées dans la même zone, comme des gares spécifiques attendant leurs trains.

Que se passe-t-il au niveau de la puce quand les ADN sont placés en contact avec elle ? Chaque ADN reconnaît sa zone et s’y fixe.

Voici une vue simplifiée d’une puce avec seulement 16 zones de fixation de l’ADN permettant de mettre en évidence 16 gènes différents. En réalité, ce type de puce est composé de milliers de zones sur une surface de moins de 2 cm².

Quand les ADN sont fermement fixés à leurs quais respectifs, la puce est analysée par un scanner capable d’identifier les différentes zones et de distinguer de très petites variations d’intensité lumineuse:

• Une zone plus intense est composée de plus d’ADN, ce qui signifie que le gène correspondant et plus activé.
• A l’inverse, si un gène est peu ou pas activé, la zone ne sera pas fluorescente.

Les deux puces sont comparées afin d’analyser les ARN transcrits sous expositions réelle et simulée.

Après analyse, les chercheurs obtiennent une liste des ADN présents dans les deux échantillons et, par conséquent, les gènes activés ou non (gènes up et down régulés) dans les cellules exposées et non exposées.

Toutefois, rappelons-nous que la puce peut fournir des informations sur 38 500 gènes! Les chercheurs doivent analyser les données afin de classer les gènes et de vérifier les niveaux d’activation dans les deux échantillons. Le travail est énorme !

A ce jour, aucun effet pathologique n’a été identifié, seulement une accélération des mécanismes physiologiques normaux.

La comparaison de la liste des gènes up- et down- régulés des deux échantillons a permis de mettre en avant les 3 gènes suivants, up-régulés. Ils sont présents au cours de l’ensemble du processus expérimental:

• thioredoxine reductase 1 (TXNRD1),
• activating transcription factor 3 (ATF3),
• membrane metallo-endopeptidase (MME).

La comparaison des échantillons exposé et contrôle au 4^e jour d’exposition met également en avant un autre gène up-régulé, Dickkopf Homolog 1 (DKK1), et un autre down-régulé,  microtubule-actin cross-linking factor 1 (MACF1).

Concernant la formation des os, les chercheurs ont également identifié une protéine spécifique, BMP2, qui est up-régulée au 12^e jour d’exposition. Cette up-régulation de BMP2 permet d’expliquer les effets biologiques observés dans toutes nos précédentes études sur les cellules, les tissus embryonnaires et les tissus osseux en croissance et en pratique clinique.

Les fonctions biologiques de ces gènes confirment les observations macroscopiques: une accélération de la différenciation au dépend de la prolifération.

Collard J.-F., Hinsenkamp M.
Cellular processes involved in human epidermal cells exposed to extremely low frequency electric fields.
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Collard J.-F., Lazar C., Nowé A., Hinsenkamp M.
Statistical validation of the acceleration of the differentiation at the expense of the proliferation in human epidermal cells exposed to extremely low frequency electric fields.
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Collard, J.-F., Mertens, B. & Hinsenkamp, M.
In vitro study of the effects of ELF electric fields on gene expression in human epidermal cells.
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Hinsenkamp M
Effets des champs électriques et électromagnétiques sur la différenciation cellulaire et leur intérêt en chirurgie orthopédique et traumatologique.
Bulletin et mémoires de l’Académie royale de médecine de Belgique, 166(7-8-9): 307-16, 2011.

Hinsenkamp M., Jercinovic A., Heenen M., De Graef Ch., Wilaert Ch.
Effects of alternating electrical current on keratinocytes in vitro (AC).
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Jercinovic A., Hinsenkamp M., Wilaert F., De graef Ch., Heenen M., Goldschmidt D.
Effects of direct constant current on keratinocytes in vitro (DC).
Bioelectroch. Bioener., 39(2): 209-214, 1996.

• Information sur les effets des champs sur les kératinocytes en PDF (724 Ko)
• Recherche BBEMG: CEM et différenciation cellulaire

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